2017年美国FDA批准CAR-T疗法上市标志着重要的里程碑。诺华公司的Kymriah以及吉利德公司的Yescarta是全球首批上市的CAR-T疗法，目前全球有多项CAR-T疗法正在申报中。与任何治疗一样，CAR-T疗法的主要挑战不仅在于安全性和有效性，还在于创建可行的商业供应链。CAR-T开发商不仅要克服安全性和有效性的障碍以通过监管部门审批，还须证明能够应对与制造相关的复杂性，并将这种个性化、时间敏感型的疗法应用至更广泛的患者群体。CAR-T制造工艺的优化是实现这些目标的关键环节之一。
CAR-T细胞制造是一个非常复杂的过程，制造难、成本高已经成为了行业发展的瓶颈问题。目前，吉利德和诺华公司均采用的是集中生产模式，首先在医院中提取患者的T细胞，然后将这些细胞运送至制造中心，在制造中心对T细胞进行基因工程设计，最后将设计后的T细胞运回医院回输至患者体内。然而，无论使用何种制造模式，成功的CAR-T细胞制造都依赖于端到端流程的优化能力，包括工作流程的简化、产能规划以及生产的可扩展性等等。传统的制造工艺以及传统设备已经不能满足行业发展需求，自动化、全封闭的新一代制造工艺是未来趋势。
随着CAR-T制造工业的发展，目前市场上已经有一些解决方案供CAR-T开发商选择，例如博雅控股集团旗下的CAR-TXpress™、美天旎的CliniMACS Prodigy™以及GE公司的FlexFactory™等，这些平台受到了整个行业的关注，业内人士也对它们充满了期待。
一个典型的CAR-T疗法流程主要分为分离、修饰、扩增、回输以及监控五个步骤。在新兴细胞治疗领域，高效分离目标细胞是细胞制品生产和质量控制的基础。传统制造工艺中，细胞分离分选常常采用Ficoll密度梯度分离法和磁珠分离法。据了解，在CAR-T制造工艺升级的道路上，CAR-TXpress™平台采用基于不同细胞组分的不同密度系数进行物理分离的X-LAB™系统以及全新的专利浮力分离法（BACS）来取代传统的Ficoll密度梯度分离法和磁珠分离法；以及采用X-Wash™系统取代了传统的离心细胞收集手段，以避免细胞清洗的数目和活力的损失。
5月初，国际细胞治疗协会（ISCT）2018年年会公布了创新浮力法细胞分选系统X-BACS™以及X-Wash™系统的最新性能数据，CAR-T细胞制造工艺的优化升级首次以数字形式呈现，有助于人们了解CAR-T制造工业的发展。
X-BACS™是一种基于浮力的细胞分选方法，将目标细胞从细胞混合物分离出来。该方法使用抗体特异性来分选细胞，使用CD3抗体在混合物中标记T细胞，并使用靶向标记T细胞的微泡从混合物中分离CD3+T细胞。
分别采用Ficoll-Hypaque和X-LAB™系统来分离MNC（单个核细胞），并采用BACS技术对这两份MNC进行CD3+T细胞分选。试验结果显示，Ficoll法制备的那份MNC经分离所得CD3+的回收率均值为83.5%，活率均值为96.3%，纯度均值为95.1% ，而X-LAB?系统制备的那份MNC经分离所得CD3+的回收率均值为89.0%, 活率均值为98.3%，纯度均值为97.3%。
简而言之，X-LAB™ 系统分离MNC后用BACS技术分选CD3+的效果优于Ficoll法分离MNC后用BACS技术分选CD3+。浮力法细胞分选系统X-BACS™可以分离获得高纯度（95%）T细胞群，且确保回收率高达85%，细胞存活率高达95%以上。该方法用标准实验室设备即可简单操作完成。
一直以来，细胞产品，如造血干细胞，在低于-135°C环境下进行为期数十年的冻存，皆采用冷冻保护剂二甲亚砜（DMSO）。虽然复苏后的细胞产品活率较高，但DMSO被认为是引发细胞回输不良反应的潜在原因，清洗已复苏细胞产品去除DMSO和细胞裂解物可以减轻某些移植并发症。X-Wash™系统法是一种简单快速清洗复苏后可回输细胞产品的方法，能够高效去除已复苏细胞产品中的DMSO，有核细胞回收率高于85%，且基本不会失活，整个过程耗时不超过1小时，并且这种方法采用标准实验室设备简单操作就能完成。
在试验中，根据供应商的操作说明将购买的健康成人冻存组织进行复苏，在已复苏产品中添加复苏清洗溶剂（含2.5%HSA、 5%葡萄聚糖以及20g/mL脱氧核糖核酸酶的生理盐水），再将样本转移至转移袋中（此步骤非必选）。将样本转移至X-Wash?系统一次性处理套件中。离心后，以正压去除废液，再以负压添加新溶剂。经最后一遍离心，细胞被收集至回收仓，溶于事先注入仓中的溶剂。试验结果显示，X-Wash™系统清洗所获CD45+细胞的总量和活率平均值分别为96.0%和93.7%；所获CD3+细胞的总量和活率平均值分别为96.3% 和92.4%。
对比发现，新一代制造工艺在细胞回收率、活性等性能上取得了显著的优化。目前，新一代CAR-T制造工艺诸如CAR-TXpress™平台融入了全新元素，不仅提高了细胞回收率等数据性能，还能够实现操作过程的自动化，避免了传统人工操作不可预期的可变性，降低制造成本、增加产品的一致性、提高运营效率、降低运营变量，有助于实现整个制造过程的标准化。
自动化、全封闭的CAR-T制造工艺是规模化生产以及降低制造成本的有效途径。随着CAR-T疗法获批上市，市场对新一代制造工艺的需求日益剧增。目前，CAR-T制造创新专利陆续问世，CAR-T细胞合同定制开发与生产制造（CDMO）的服务模式也开始进入国内外市场，CAR-T疗法迎来了全新发展阶段，有望造福更多患者！
参考文献：
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